蟲草素是從傳統(tǒng)藥用蟲草菌蛹蟲草中分離得到的，因其具有多種臨床功能而受到廣泛關(guān)注。既往報道的添加L-丙氨酸可顯著提高蟲草素的產(chǎn)量，但其分子機(jī)制尚不清楚。華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林俊芳教授團(tuán)隊對添加L-丙氨酸誘導(dǎo)產(chǎn)生兩倍蟲草素的蛹蟲草進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)兩個關(guān)鍵的Zn2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子CmTf1和CmTf2通過編碼基因的過表達(dá)，被證實具有使蟲草素產(chǎn)量加倍的作用。轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)揭示了蟲草素合成中具有高靈活性的關(guān)鍵限速酶和轉(zhuǎn)錄因子，并繪制了蛹蟲草中從底物氨基酸到產(chǎn)物蟲草素的代謝網(wǎng)絡(luò)圖。

L-丙氨酸被證明對產(chǎn)生蟲草素的效果最好（Kang et al.,2014）。為揭示蟲草素的代謝途徑，本研究以L-丙氨酸為誘導(dǎo)劑，提高蛹蟲草中蟲草素的產(chǎn)量。在液體靜態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天后，蟲草素的產(chǎn)量是未添加L-丙氨酸的蟲草素產(chǎn)量的2.1倍（圖1B）。此外，補(bǔ)充提出了變色和原基形成階段。由于蟲草素是一種無色核苷類似物，生長特性中的顏色差異可能是由于較高濃度的色素積累所致（圖1A）。一般來說，原基是由一定數(shù)量的蛹蟲草菌絲體聚集而成。菌絲生長速度的提高會積累更多的菌絲，使原基提前產(chǎn)生。蛹蟲草早期原基的形成表明，L-丙氨酸可能通過提高菌絲生長速度來增加蟲草素的產(chǎn)量。

圖1.四個研究樣本的特征。（A）培養(yǎng)30天后在玻璃瓶中的四個樣品的生長特征。（B）每個玻璃罐中的蟲草素產(chǎn)量。

為了弄清從添加的L-丙氨酸到蟲草素的代謝途徑，收集了四個樣品并進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序。利用蛹蟲草參考數(shù)據(jù)庫中的注釋對轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)進(jìn)行了進(jìn)一步的闡述，結(jié)果表明大約80%的基因在蛹蟲草菌絲體期表達(dá)。將測序數(shù)據(jù)上傳到GO和KEGG數(shù)據(jù)庫。差異表達(dá)基因(DEGs)的GO分類結(jié)果表明，添加劑可以改善代謝過程，產(chǎn)生更多的代謝物，從而激活膜運(yùn)輸以避免蟲草素難以負(fù)擔(dān)的過量生產(chǎn)。KEGG分類顯示大多數(shù)DEG與個體生長和代謝途徑有關(guān)，這表明補(bǔ)充L-丙氨酸可能會影響特定的氨基酸代謝和能量代謝。KEGG注釋結(jié)果和網(wǎng)絡(luò)圖，L-丙氨酸可以通過激活氨基酸互變來提高蟲草素的產(chǎn)量。五個氨基酸（半胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸和天冬氨酸）在相互轉(zhuǎn)化中表現(xiàn)出明顯的功能，并直接刺激組氨酸代謝的代謝物質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而間接參與了蟲草素的合成途徑。KEGG途徑ko01100的顯著變化，表明添加L-丙氨酸增加了能量分子的產(chǎn)生并進(jìn)一步促進(jìn)了蟲草素的生產(chǎn)。

圖2.基因本體論和路徑分析。（A）DEG的GO分類（x軸表示DEG的數(shù)量，y軸表示GO項）。（B）DEGs的富集。列的顏色表示校正后的P值：（高，黃色；低，橙色）或本體（藍(lán)色，分子功能；粉紅色，細(xì)胞成分；綠色，生物學(xué)過程）。（C）DEG的路徑分類（x軸表示DEG的數(shù)量，y軸表示路徑名稱）。

Zn2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子（TF）家族是蛹蟲草子實體形成的重要組成部分。其中影響氨基酸代謝和蟲草素產(chǎn)生的相關(guān)基因主要是CCM_02568和CCM_01481。在添加L-丙氨酸的情況下，這些基因在蛹蟲草中過度表達(dá)，從而提高了蟲草素的含量。

本研究中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和先前報道的數(shù)據(jù)的結(jié)合揭示了蛹蟲草發(fā)酵過程中L-丙氨酸添加對蟲草素產(chǎn)生影響的可靠代謝網(wǎng)絡(luò)圖（圖3）。L-丙氨酸的加入通過激活能量生成和氨基酸相互轉(zhuǎn)化途徑提高了蟲草素的產(chǎn)量。在能量產(chǎn)生的生物途徑中，激活的丙酮酸激酶和質(zhì)膜H+-ATP酶直接增加ATP的積累，而Zn2Cys6 TFs（CCM_02568和CCM_01481）以一些未知的方式促進(jìn)活性，產(chǎn)生更多的能量。額外消耗ATP可產(chǎn)生大量的ADP和AMP，它們是腺苷的前體。另一方面，L-丙氨酸參與了氨基酸的相互轉(zhuǎn)化，大量的L-丙氨酸加速了氨基酸的形成。這些氨基酸通過組氨酸代謝，間接促進(jìn)了腺苷前體IMP的積累。腺苷酸、肌苷酸及其中間產(chǎn)物（腺嘌呤、肌苷和腺苷酸琥珀酸）與腺苷反應(yīng)的酶因腺苷酸和肌苷酸充足而處于活躍階段，因此，過量的腺苷酸和能量增加了蟲草素的產(chǎn)生。

圖3.蟲草中的蟲草素代謝和生物合成途徑。彩色顯示的百分比表示該基因的轉(zhuǎn)錄水平高于樣品中DEGs的多少基因（CMsI，藍(lán)色；CMsII，橙色）的比率。虛線表示間接作用。實線箭頭表示直接作用。

本研究揭示了蟲草素合成中具有高靈活性的關(guān)鍵限速酶和轉(zhuǎn)錄因子，并繪制了蛹蟲草中從底物氨基酸到產(chǎn)物蟲草素的代謝網(wǎng)絡(luò)圖。對蟲草素生成的關(guān)鍵節(jié)點有了清晰的認(rèn)識，為今后提高蟲草素產(chǎn)量和菌種選育提供了更好的基礎(chǔ)。

原文發(fā)表于：Frontiers in Microbiology, 24 April 2020 https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.00577 （翻譯：菌物健康）